Impact of neural cell type and differentiation state on alpha-synuclein aggregation
Impact of neural cell type and differentiation state on alpha-synuclein aggregation
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Original abstract
Hintergrund und Ziele Alpha-Synukleinopathien, einschließlich des Morbus Parkinson (PD) und der Multisystem-atrophie (MSA), sind eine Klasse von neurodegenerativen Bewegungsstörungen, die durch eine pathologische Aggregation und Ablagerung des Proteins Alpha-Synuclein (aSyn) ge-kennzeichnet sind. Bei der Parkinson-Krankheit bildet das aggregierte aSyn die Hauptkom-ponente der Lewy-Körperchen (LB) und Lewy-Neuriten (LN) in den Neuronen bei PD. In ähnlicher Weise stellt es bei MSA den Hauptbestandteil der glialen zytoplasmatischen Ein-schlüsse (GCI) in Oligodendrozyten (OL) dar. Diese aSyn-Aggregate führen zu neuronaler oder oligodendroglialer Dysfunktion und anschließendem neuronalen Verlust in bestimmten Hirnregionen, was zu den krankheitstypischen motorischen und nicht-motorischen Symp¬to¬men führt. Die genauen Mechanismen und Ursachen der aSyn-Aggregation sind jedoch noch nicht vollständig geklärt. Es ist besonders bemerkenswert, dass bestimmte Zelltypen für die aSyn-Aggregation anfällig sind. Bei PD sind die dopaminergen Neuronen des Mittelhirns (mDANs) erheblich von der aSyn-Akkumulation betroffen. Interessanterweise sammelt sich aSyn bei MSA auch in OLs an, obwohl OLs kaum aSyn synthetisieren. Diese zelltypselektive Anfälligkeit wirft die Frage auf, ob die unterschiedlichen zelluläre Milieus die aSyn-Aggregation beeinflussen. In dieser Arbeit wird die Neigung zur aSyn-Aggregation in verschiedenen neuralen Zellty-pen, einschließlich kortikaler Projektionsneuronen (CPNs) und mDANs, sowie in OLs un-tersucht. Angesichts der entscheidenden Rolle der Autophagie (autophagy lysosomal pathway, ALP) beim Abbau von aSyn wurden auch Unterschiede im ALP untersucht, um dessen Einfluss auf die zelltypabhängige aSyn-Aggregation zu verstehen. Methoden Um den Einfluss des Zelltyps zu untersuchen, wurden CPNs und mDANs verwendet, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) differenziert wurden. Diese hiPSCs wurden von zwei PD-Patienten mit einer heterozygoten Duplikation des aSyn-kodierenden Gens (SNCA) und von einer gesunden Kontrollperson gewonnen, was einen Vergleich der aSyn-Aggregation in autologen CPNs und mDANs ermöglicht. Zum Vergleich der aSyn-Aggregationsmuster in OLs und Neuronen wurden außerdem central glia 4 (CG4)-Zellen aus der Ratte, die Wildtyp-aSyn überexprimieren (CG4 WTS), und Lund human mesencephalic (LUHMES)-Zellen, die Wildtyp-aSyn überexprimieren (LUHMES WTS), sowie die entsprechenden Kontrollzellen ohne aSyn-Überexpression verwendet. Differenzierte CG4- und LUHMES-Zellen in verschiedenen Varianten dienten als OL- bzw. neuronale Modelle. Die Überexpression von aSyn in CG4- und LUHMES WTS-Zellen wurde mit einem identischen lentiviralen Konstrukt erreicht, was einen Vergleich der aSyn-Aggregation in OLs und Neuronen in vitro ermöglichte. Zusätzlich wurden transgene Mausmodelle eingesetzt, die aSyn in OLs oder Neuronen überexprimieren, angetrieben durch MBP- (MBP-SNCA) bzw. Thy1-Promotoren (Thy1-SNCA), um den Einfluss des Zelltyps auf die aSyn-Aggregation in vivo zu vergleichen. Die aSyn-Aggregation in Zellen und im Striatum von Mäusegehirnen wurde mittels einer Löslichkeitsanalyse untersucht. Dabei wurde aSyn anhand seiner Löslichkeit durch eine Reihe von Ultrazentrifugationsschritten aufgetrennt, gefolgt von einer Western-Blot-Analyse mit Antikörpern gegen aSyn. Zur Aufklärung der Mechanismen, die der zelltypabhängigen aSyn-Aggregation zugrunde liegen, wurde die ALP durch Western-Blot-Analyse der wichtigsten ALP-Marker p62 und LC3-II charakterisiert. Ergebnisse und Beobachtungen In hiPSC-Neuronen führte die Überexpression von aSyn aufgrund der SNCA-Genduplikation in mDANs zu einer erhöhten aSyn-Aggregation und einem erhöhten Oligomer/Monomer-Verhältnis im Vergleich zu den CPNs. Die In-vivo-Daten zeigten, dass die MBP-vermittelte aSyn-Überexpression im Vergleich zur Thy1-vermittelten aSyn-Überexpression oder zu nicht-transgenen Kontrolltieren zu stärker erhöhten aSyn-Aggregationswerten führte. Dieser Befund lässt auf eine erhöhte aSyn-Aggregationsneigung bei induzierter aSyn-Überexpression in OLs im Vergleich zu Neuronen schließen. In-vitro-Untersuchungen von CG4 WTS- und LUHMES WTS-Zellen zeigten einen deutlichen Anstieg der aSyn-Gesamtkonzentration in CG4 WTS-Zellen im Vergleich zu LUHMES WTS-Zellen. Es wurden jedoch keine signifikanten Unterschiede in der aSyn-Aggregation zwischen CG4- und LUHMES WTS-Zellen per Löslichkeitsanalyse festgestellt. Interessanterweise wurde sowohl in CG4- als auch in LUHMES-Modellen unabhängig von der aSyn-Überexpression ein differenzierungsabhängiger Effekt festgestellt, was zeigt, dass differenzierte Zellen anfälliger für die aSyn-Aggregation sind. Die Unterschiede in den aSyn-Aggregationsmustern, die mit verschiedenen Zelltypen und Differenzierungszuständen verbunden sind, scheinen mit unterschiedlichen ALP-Mustern zusammenzuhängen. Insbesondere MBP-SCNA-Mäuse, bei denen aSyn in OLs überexprimiert wird, wiesen im Vergleich zu neuronal aSyn-überexprimierenden Thy1-SNCA-Mäusen signifikant höhere Werte von p62 und niedrigere Werte von LC3-II auf. Darüber hinaus wurden unterschiedliche ALP-Muster zwischen proliferierenden und differenzierten LUHMES- und CG4-Zellen beobachtet, wobei differenzierte Zellen unter Basalbedingungen deutlich niedrigere LC3-II-Konzentrationen aufwiesen. Interessanterweise wurde bei ALP-Hemmung mit Bafilomycin A1 eine stärkere aSyn-abhängige Wirkung in differenzierten CG4 WTS-Zellen im Vergleich zu ihren proliferierenden Pendants festgestellt. In differenzierten CG4 WTS-Zellen führte die Überexpression von aSyn zu erhöhten LC3-II-Werten bei unveränderten p62-Werten. Schlussfolgerungen und Diskussion Die Ergebnisse dieser Studie verdeutlichen den signifikanten Einfluss des neuralen Zelltyps und des Differenzierungsstatus auf die aSyn-Aggregation. Insbesondere aSyn überexprimie¬rende mDANs sind anfälliger für aSyn-Aggregation als autologe CPNs und Neuronen mit normalen aSyn-Werten. Außerdem stützen sowohl in-vivo- als auch in-vitro-Daten die Vorstellung, dass aSyn in OLs im Vergleich zu Neuronen eher zur Aggregation neigt (in-vivo) oder höhere Spiegel aufweist (in-vitro), was wahrscheinlich auf eine verringerte Abbaukapazität oder eine geringere Umsatzrate in OLs zurückzuführen ist. Zudem ist die Neigung zur aSyn-Aggregation in differenzierten Zellen größer als in proliferierenden Zellen. Darüber hinaus unterstreicht diese Studie den Zusammenhang zwischen der aSyn-Aggregationsneigung und dem ALP. Die erhöhten Konzentrationen von aggregiertem aSyn im Striatum von MBP-SNCA-Mäusen im Vergleich zu Thy1-SNCA-Mäusen gehen mit reduzierten LC3-II-Konzentrationen, aber erhöhten p62-Konzentrationen einher, was auf eine verringerte Kapazität zur Autophagosomenbildung und eine Blockade des autophagischen Flusses hindeutet, was wiederum auf eine reduzierte ALP-Funktion in MBP-SNCA-Mäusen hinweist. In ähnlicher Weise scheint der ALP in differenzierten Zellen eingeschränkt zu sein, was durch niedrigere LC3-II-Spiegel belegt wird, was auf eine verringerte Fähigkeit zur Autophagosomenbildung hindeutet. Darüber hinaus scheinen differenzierte OLs mit aSyn-Überexpression im Vergleich zu proliferierenden Zellen anfälliger für Bafilomycin A1-induzierte ALP-Beeinträchtigungen zu sein. Dies zeigt sich in einer verstärkten Bildung von Autophagosomen (erhöhte LC3-II-Werte), aber einer geringeren Fusion mit Lysosomen zum Proteinabbau (Akkumulation von p62), was mit ihrer Anfälligkeit für aSyn-Aggregation im Vergleich zu proliferierenden Zellen einhergeht. Diese Ergebnisse liefern mechanistische Erkenntnisse, die mit der beobachteten Zunahme der aSyn-Pathologie mit zunehmendem Alter und der verminderten Effizienz des Proteinabbaus in neuralen Zellen in Einklang stehen. Diese Arbeit unterstreicht die maßgebende Rolle des ALP als entscheidender Signalweg bei der zelltypabhängigen aSyn-Aggregation und unterstreicht seine Bedeutung als Ziel für die Entwicklung künftiger therapeutischer Ansätze für verschiedene Synucleinopathien. Teilergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden veröffentlicht in: Brazdis RM, Alecu JE, Marsch D, Dahms A, Simmnacher K, Lorentz S, et al. Demonstration of brain region-specific neuronal vulnerability in human iPSC-based model of familial Parkinson's disease. Hum Mol Genet. 2020;29(7):1180-91. Background and Aims Alpha synucleinopathies, including Parkinson’s disease (PD) and multisystem atrophy (MSA), are a class of neurodegenerative movement disorders characterized by pathological aggregation and deposition of the protein alpha-synuclein (aSyn). In PD, aggregated aSyn forms the major component of Lewy bodies (LB) and Lewy neurites (LN) in neurons of PD. Similarly, in MSA, it constitutes the primary component of glial cytoplasmatic inclusions (GCI) in oligodendrocytes (OL). These aSyn aggregates leads to neuronal or oligodendroglial dysfunction and subsequent neuronal loss in specific brain regions, resulting in disease-typical motor and non-motor symptoms. However, the precise mechanisms and causes of aSyn aggregation remain incompletely understood. It is particularly noteworthy that specific cell types are vulnerable to aSyn aggregation. In PD, midbrain dopaminergic neurons (mDAN) are significantly affected by aSyn accumulation. Interestingly, aSyn also accumulates in OLs in MSA, even though OLs scarcely synthesize aSyn. This cell type-selective vulnerability raises the question of whether distinct cellular milieus influence aSyn aggregation. This work investigates the propensity for aSyn aggregation in various neural cell types, including cortical projection neurons (CPN) and mDANs, as well as in OLs. Given the crucial role of the autophagy-lysosomal pathway (ALP) in clearing aSyn, differences in the ALP were also examined to understand its impact on cell type-dependent aSyn aggregation. Methods To explore the effect of cell type, CPNs and mDANs differentiated from human-induced pluripotent stem cells (hiPSC) were used. These hiPSCs were generated from two PD patients with a heterozygous duplication of the aSyn coding gene (SNCA) and from a healthy control, allowing comparison of aSyn aggregation in autologous CPNs and mDANs. Further, to compare aSyn aggregation patterns in OLs and neurons, rat central glia 4 (CG4) cells overexpressing the wild-type aSyn (CG4 WTS) and Lund human mesencephalic (LUHMES) cells overexpressing the wild-type aSyn (LUHMES WTS), as well as their respective control cells without aSyn overexpression were used. Differentiated CG4 and LUHMES cells of various variants served as OL and neuronal models, respectively. aSyn overexpression in CG4- and LUHMES WTS cells was achieved using an identical lentiviral construct, facilitating a comparison of aSyn aggregation in OLs and neurons in vitro. Additionally, transgenic mouse models overexpressing aSyn in OLs or neurons, driven by MBP (MBP-SNCA) or Thy1 (Thy1-SNCA) promoters, respectively, were employed to compare the impact of cell type on aSyn aggregation in vivo. aSyn aggregation in cells and the striatum of mouse brains were evaluated via a solubility analysis. This involved separating aSyn based on its solubility through a series of ultracentrifugation steps, followed by Western blot analysis using antibodies against aSyn. To elucidate mechanisms underlying cell type-dependent aSyn aggregation, the ALP was characterized using Western blot analysis of key ALP markers, p62 and LC3-II. Results In hiPSC-derived neurons, overexpression of aSyn due to SNCA-gene duplication in mDANs led to increased aSyn aggregation and an elevated oligomer/monomer ratio compared to the CPNs. In vivo study demonstrated that MBP-driven aSyn overexpression led to more strongly elevated aSyn aggregation levels as compared to Thy1-driven aSyn overexpression or non-transgenic control animals. This finding suggests an increased aSyn aggregation propensity, when aSyn overexpression was induced in OLs compared to neurons. In vitro study of CG4 WTS and LUHMES WTS cells demonstrated a remarkably increase in total aSyn levels in CG4 WTS cells compared to LUHMES WTS cells. However, no significant differences in aSyn aggregation, as assessed by the solubility assay, were observed between CG4- and LUHMES WTS cells. Interestingly, a differentiation-dependent effect was detected in either CG4 or LUHMES models regardless of aSyn overexpression, demonstrating differentiated cells being more prone to aSyn aggregation. The differences in aSyn aggregation patterns linked to different cell types and differentiation states appeared to be associated to distinct ALP patterns. Specifically, MBP-SCNA mice, where aSyn is overexpressed in OLs, exhibited significantly higher levels of p62 and lower levels of LC3-II compared to neuronal aSyn overexpressing Thy1-SNCA mice. Additionally, distinct ALP patterns were observed between proliferating and differentiated LUHMES and CG4, with differentiated cells showing markedly lower levels of LC3-II under basal conditions. Interesting, upon ALP inhibition with Bafilomycin A1, a stronger aSyn-dependent effect was noted in differentiated CG4 WTS cells compared to their proliferating counterparts. In differentiated CG4 WTS cells, aSyn overexpression led to increased LC3-II levels, while p62 levels remained unchanged. Conclusions and discussion The results of this study highlight the significant impact of neural cell type and differentiation state on aSyn aggregation. Specifically, aSyn overexpressing mDANs are more susceptible to aSyn aggregation than autologous CPNs and neurons with normal aSyn levels. Additionally, both in vivo and in vitro data support the notion that aSyn in OLs tends to be more prone to aggregation (in vivo) or exhibit a higher level (in vitro) compared to neurons, likely due to reduced clearance capacity or declined turnover rate in OLs. Furthermore, aSyn aggregation in differentiated cells is more prone to aggregation than in proliferating cells. Moreover, this study underscores the association of aSyn aggregation propensity and the ALP. The elevated levels of aggregated aSyn in the striatum of MBP-SNCA mice compared to Thy1-SNCA mice are accompanied by reduced LC3-II levels however elevated p62 levels, suggesting a diminished capacity for autophagosome formation and a blockage in autophagy flux, thereby indicating reduced ALP function in MBP-SNCA mice. Similarly, the ALP in differentiated cells appears to be limited, as evidenced by lower LC3-II levels, pointing to a reduced capacity for autopahgosome formation. Additionally, differentiated OLs with aSyn overexpression seem more susceptible to Bafilomycin A1-induced ALP impairments compared to proliferating cells. This is indicated by increased autophagosome formation (elevated LC3-II levels) but decreased fusion with lysosomes for protein degradation (accumulation of p62), which coincides with their susceptibility to aSyn aggregation compared to proliferating cells. These findings provide mechanistic insight that aligns with the observed increase in aSyn pathology with ageing and reduced efficiency of protein clearance in neural cells. This work emphasizes the crucial role of ALP as a decisive pathway in cell type-dependent aSyn aggregation, reinforcing its importance as a target for developing future therapeutic approaches for distinct synucleinopathies. Partial results presented in this thesis were previously published in: Brazdis RM, Alecu JE, Marsch D, Dahms A, Simmnacher K, Lorentz S, et al. Demonstration of brain region-specific neuronal vulnerability in human iPSC-based model of familial Parkinson's disease. Hum Mol Genet. 2020;29(7):1180-91.