Contribution à l’étude de la régulation des complexes respiratoires par la phosphorylation chez Saccharomyces cerevisiae : -Etude générale du protéome et du phosphoprotéome mitochondrial selon le métabolisme -Cas particulier de deux sous-unités du complexe cytochrome c oxydase
Contribution à l’étude de la régulation des complexes respiratoires par la phosphorylation chez Saccharomyces cerevisiae : -Etude générale du protéome et du phosphoprotéome mitochondrial selon le métabolisme -Cas particulier de deux sous-unités du complexe cytochrome c oxydase
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Original abstract
La phosphorylation oxydative est un processus majeur du métabolisme énergétique qui est catalysée par les enzymes de la chaîne respiratoire (OXPHOS), localisées dans la membrane interne des mitochondries. Sa dérégulation est souvent associée à des pathologies, par exemple aux maladies mitochondriales et neurodégénératives. La régulation de la phosphorylation oxydative par la phosphorylation reste encore peu comprise et peu étudiée. Pourtant, la phosphorylation est une des modifications post-traductionnelles les plus répandues dans la cellule, régulant de nombreux aspects de la vie cellulaire et dont l’altération est associée à des pathologies au niveau cellulaire (Alzheimer, Parkinson, cancer). Concernant la phosphorylation oxydative, il est à noter que quelques sites de phosphorylation des complexes respiratoires, en particulier du complexe IV, ont été montrés comme ayant un effet sur leur stabilité et/ou leur activité. Toutefois la connaissance du phosphoprotéome mitochondrial n’est pas suffisamment documentée à ce jour pour identifier les différents rôles que pourraient jouer la phosphorylation au niveau de la mitochondrie et en particulier, de la chaîne respiratoire. Dans la première partie de la thèse, nous nous sommes intéressés à l’analyse du phosphoprotéome mitochondrial de Saccharomyces cerevisiae dans trois conditions de culture : respiratoire (YLAC), respiro-fermentaire (YPGalA) et fermentaire (YPGA). Nous avons quantifiés près de 300 sites de phosphorylation dans la mitochondrie, dont 90 ont un niveau de phosphorylation variable selon le substrat. Les données que nous avons obtenues constituent une base pour l’analyse de la phosphorylation mitochondriale et de la compréhension de son mécanisme. Les sites de phosphorylation de la voie métabolique énergie sont ceux présentant le plus de variation de leur niveau de phosphorylation. La localisation des résidus phosphorylés sur la structure des complexes respiratoires nous a permis d’émettre des hypothèses sur le rôle de ces résidus. Afin de normaliser la quantité des résidus phosphorylés dans les trois conditions de culture, nous avons aussi quantifié le protéome mitochondrial dans les trois conditions de culture. Ceci nous a permis d’argumenter en faveur d’un métabolisme respiro-fermentaire en YPGalA, question encore largement discutée à ce jour. Enfin, cette première étude quantitative du protéome et phosphoprotéome mitochondrial constitue une avancée dans l’étude de la régulation de la mitochondrie par la phosphorylation. Elle peut notamment apporter des informations applicables à l’étude du cancer : en effet, les cellules saines ont un métabolisme respiratoire tandis que les cellules tumorales, dérégulées, ont un métabolisme fermentaire. La seconde partie de la thèse concerne l’analyse du rôle de deux sous-unités du complexe IV de la chaîne respiratoire : les sous-unités Cox12p et Cox13p, encore peu étudiées à ce jour. De plus, deux sites de phosphorylation ont été identifiés sur la sous-unité Cox12p. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés au rôle de ces sous-unités, notamment au niveau de l’assemblage et de l’activité du complexe IV, en analysant des mutants Δcox12, Δcox13 et Δcox12Δcox13. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés au rôle des deux sites de phosphorylation de Cox12p : Ser7 et ser82. Nous avons généré les mutants phosphomimétiques de ces deux résidus et étudié leurs effets sur la stabilité et/ou l’activité du complexe IV. Cette seconde étude nous a notamment permis d’identifier un rôle de Cox12p sur la stabilité du complexe et un rôle de Cox13p dans sa dimérisation. La phosphorylation de Cox12p au niveau de la Ser7 semble aussi déstabiliser le complexe IV. De plus, la phosphorylation de la Ser7 et de la Ser82 semblent influencer l’interaction du cytochrome c avec le complexe IV. Cette hypothèse reste à vérifier mais est pertinente du fait de la proximité de Cox12p avec Cox2p, qui porte le lieu de fixation du cytochrome c.