Cross-seeding von Alpha-Synuclein und Beta-Amyloid-Peptiden im transgenen Tiermodell mit Amyloid-Pathologie
Cross-seeding von Alpha-Synuclein und Beta-Amyloid-Peptiden im transgenen Tiermodell mit Amyloid-Pathologie
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Original abstract
Neurodegenerative Erkrankungen wie die Alzheimersche Erkrankung (AD) und der Morbus Parkinson treten altersabhängig auf und werden für unsere alternde Gesellschaft zu einer zunehmenden Herausforderung (Gauthier et al. 2021). Es wird angenommen, dass für die Initiierung und Manifestation pathogener Prozesse bei neurodegenerativen Erkrankungen spezifische krankheitsbezogene Proteinvarianten verantwortlich sind (Rheinbaben & Werner 2014). Der Morbus Parkinson ist neuropathologisch durch spezifische Degeneration dopaminerger Neuronen der Substantia nigra und durch Bildung von Lewy-Körperchen und Lewy-Neuriten aus aggregiertem Alpha-Synuclein (α-Syn) gekennzeichnet (Spillantini et al. 1997; Dickson 2018). Unter physiologischen Bedingungen wird davon ausgegangen, dass α-Syn ein nativ ungefaltetes Protein ist; es gibt allerdings Hinweise darauf, dass es verschiedene Konformationen annehmen kann (Maroteaux et al. 1988; Lashuel et al. 2013). Ein histopathologisches Merkmal der AD ist die sukzessive Aggregation von Beta-Amyloid-Peptiden (Aβ) zu Oligomeren, Fibrillen und Plaques (Hardy & Higgins 1992; Braak & Braak 1996). Eine postulierte Koaggregation von Proteinen, die für verschiedene Krankheitsbilder typisch sind, tritt zunehmend in den Fokus der Forschung. Ein genaueres Verständnis dieser krankheitsübergreifenden Mechanismen könnte helfen, die Ätiologie neurodegenerativer Erkrankungen besser zu verstehen (Masliah et al. 2001; Tsigelny et al. 2008; Atsmon-Raz & Miller 2016; Lim 2019). In dieser Arbeit sollte mit immunhistochemischen Methoden das Vorkommen und eine mögliche Kolokalisation von α-Syn und Aβ in einem Mausmodell mit alzheimertypischen Plaques untersucht werden. Es wurde das tg2576 Mausmodell gewählt, welches humanes Amyloidvorläuferprotein (Amyloid Percusor Protein; APP) mit einer Doppelmutation überexprimiert und das durch die extrazelluläre Aggregation von Aβ-Peptiden gekennzeichnet ist (Hsiao et al. 1996). Es wird davon ausgegangen, dass α-Syn in unterschiedlichen Konformationen und Modifikationen verschiedene noch nicht tiefergehend erforschte Aufgaben erfüllt (Lashuel et al. 2013; Fakhree et al. 2018). Deshalb wurden für diese Erhebung 12 verschiedene Antikörper (AK) gegen definierte α-Syn Epitope getestet und das jeweilige histologische Bild in Wildtyp, APP-transgenen und α-Syn Knock-out Mäusen beschrieben und bewertet. Des Weiteren wurde untersucht, wo sich α-Syn im Gehirn des AD-Mausmodells mittels der jeweiligen Antikörper lokalisieren lässt und ob sich diese Muster im Altersverlauf ändern. Mit Doppelimmunfluoreszenz-Färbungen von α-Syn und Aβ wurde eine mögliche Kolokalisation dieser beiden Proteine an senilen Plaques untersucht. Konkret sollten folgende Fragestellungen beantwortet werden: 1. Zeigen Antikörper gegen α-Syn, die an verschiedenen Stellen des Proteins binden, gleiche oder unterschiedliche histologische Verteilungsmuster? 2. Gibt es einen Unterschied in der Expression beziehungsweise Lokalisation von endogenem α-Syn in Mäusen mit und ohne Aβ-Pathologie? 3. Ist die α-Syn-Immunreaktivität während des Alterungsprozesses von tg2576 Mäusen verändert? 4. Gibt es Hinweise auf eine Beteiligung von Gliazellen an der α-Syn-Lokalisation im Gehirn von tg2576 Mäusen? 5. Ist eine Kolokalisation von α-Syn und Aβ im tg2576 Gehirn mit Aβ-Pathologie nachweisbar? Zur Beantwortung dieser Fragen konnten folgende Erkenntnisse gewonnen werden: 1. Für die verschiedenen a-Syn-Antikörper wurden unterschiedliche Markierungsmuster in wt Tieren nachgewiesen, die eine Klassifizierung in drei verschiedene Kategorien erlauben: (I) AK mit somatischer Färbespezifität, (II) AK mit primär synaptischer Färbespezifität und (III) spezifische Detektion von α-Syn Phosphoserin 129. Die somatische Anfärbung des physiologischen α-Syn in Neuronen von wt Tieren erfolgte vor allem durch AK welche am N-Terminus die amphipathische Region markieren. Die synaptische α-Syn-Präsenz wurde eher durch AK, welche an die NAC-Region beziehungsweise an den C-Terminus binden, dargestellt. 2. Es zeigte sich bei allen in dieser Studie untersuchten α-Syn-AK sowohl in den wildtyp als auch in den APP-transgenen tg2576 Tieren eine somatische beziehungsweise synaptische neuronale Färbung des α-Syn. Alle fünf in der Arbeit verwendeten polyklonalen Kaninchen AK färbten punktförmige Ablagerungen (Deposits), Lewy-Körper-ähnliche Aggregate im Hypothalamus und in Amyloid-Plaque assoziierten reaktiven Astrozyten. Dies deutet darauf hin, dass diese AK aggregierte α-Syn-Fibrillen erkennen. Fast alle α-Syn-Antikörper hoben dystrophe Neuriten an Plaques im Gehirn von Mäusen mit Aβ-Pathologie hervor. 3. Während des Alterungsprozesses nimmt die Plaquebeladung im Hirngewebe von APP-transgenen tg2576 Mäusen und damit auch die Gesamtzahl α-Syn-positiver dystropher Neuriten und Astrozyten zu (Hsiao et al. 1996). Deren quantitative Zunahme pro Plaque im Altersgang war aufgrund der Stichprobenuntersuchung nicht eindeutig nachweisbar. 4. Der Plaque-assoziierte Nachweis von α-Syn in gliaähnlichen Zellen war ein unerwartetes Ergebnis der Studie. Eine Beteiligung von Gliazellen an der α-Syn-Expression in tg2576 Tieren wurde insbesondere mit den Antikörpern nachgewiesen, die α-Syn-Epitope zwischen Aminosäure 13 und 85 erkennen. Diese Regionen befinden sich am hydrophoben N-Terminus beziehungsweise innerhalb der NAC-Domäne. Doppelimmunfluoreszenz-Färbungen mit einem etablierten Astrozytenmarker (GFAP) zeigten, dass es sich bei den gliaähnlichen α-Syn-positiven Zellen um Astrozyten handelt. Interessanterweise waren nicht alle Plaque-assoziierten Astrozyten immunreaktiv für α-Syn. 5. Durch Doppelimmunfluoreszenz-Färbungen konnte nachgewiesen werden, dass α-Syn sowohl in der Peripherie von Aβ-Plaques als auch direkt im Plaquebereich lokalisiert werden kann. Hierbei ist interessant, dass die AK, welche hauptsächlich somatisches α-Syn färben, auch inmitten von Plaques α-Syn detektieren, während die AK, welche α-Syn vor allem synaptisch zeigen, vornehmlich α-Syn in dystrophen Neuriten am Rand der Aβ-Plaques markieren. Diese Ergebnisse sind ein Hinweis darauf, dass bestimmte Modifikationen und Konformationen des α-Syn an der Aggregation mit Beta-Amyloid Peptiden im Gehirn von transgenen Mäusen mit Beta-Amyloid-Pathologie beteiligt sein könnten. Es kann daraus geschlossen werden, dass differentielle Bindungseigenschaften von α-Syn-Antikörpern in gesundem Gewebe verglichen mit Hirnregionen von tg2576 Tieren mit Beta-Amyloid-Pathologie unterschiedliche physiologische und pathologische Konformationszustände von α-Syn widerspiegeln, zu denen auch Formen gehören, die mit Beta-Amyloid vermutlich koaggregieren. Zukünftige Studien sollten zeigen, wo solche Koaggregate im Gehirn von AD-Patienten vorhanden sind und ob sie posttranslationalen Modifikationen von α-Syn und Aβ zugeordnet werden können.:INHALTSVERZEICHNIS 1. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 1 2. EINFÜHRUNG 3 2.1. Neurodegenerative Erkrankungen 4 2.2. Morbus Alzheimer 5 2.1.1. β-Amyloid-Pathologie 7 2.1.2. Astrogliose bei der Alzheimer Demenz 9 2.1.3. Das Mausmodell tg2576 9 2.3. Morbus Parkinson 10 2.3.1. α-Synuclein Pathologie 10 2.4. Prionen- und Cross-seeding Hypothese 12 3. AUFGABENSTELLUNG 14 4. MATERIAL UND METHODEN 15 4.1. Material 15 4.1.1. Chemikalien 15 4.1.2. Puffer 15 4.1.3. Antikörper 16 4.1.3.1. Primäre Antikörper 16 4.1.3.2. Sekundäre Antikörper 17 4.1.3. Verwendete Geräte 18 4.1.4. Verwendete Mikroskope 18 4.2. Untersuchte Tiere 19 4.3. Hirnpräparation und Immunhistochemie 19 4.4. Färbemethoden 20 4.4.1. Darstellung von Zellkernen 20 4.4.2. Immunhistochemische Färbungen 20 4.4.2.1. DAB-Färbung 20 4.4.2.2. Doppelimmunfluoreszenz-Färbung 21 4.5. Bestimmung geeigneter Antikörperkonzentrationen 22 5. ERGEBNISSE 23 5.1. Optimierung der immunhistochemischen Färbeprotokolle 23 5.2. Darstellung von α-Synuclein im Gehirn von Mäusen 23 5.2.1. α-Synuclein Antikörper mit vorwiegend somatischer Färbespezifität 24 5.2.2. α-Synuclein Antikörper mit vorwiegend synaptischer Färbespezifität 26 5.2.3. Spezifische Detektion von α-Synuclein phosphoSerin 129 28 5.3. Nachweis von α-Synuclein im tg2576 Mausmodell 31 5.4. Screening von α-Synuclein im Gehirn von tg2576 Mäusen 34 5.5. Veränderung der α-Synuclein Expression während des Alterungsprozesses 35 5.6. Doppelimmunfluoreszenz-Färbungen 37 5.6.1. α-Synuclein und Astrozyten 37 5.6.2. α-Synuclein und β-Amyloid 39 6. DISKUSSION 41 6.1. Methodische Betrachtung 41 6.2. Diskussion der Ergebnisse 43 6.2.1. Nachweis von α-Synuclein mit verschiedenen Antikörpern 43 6.2.2. Expression und Lokalisation von endogenem α-Synuclein in Mäusen mit und ohne β-Amyloid-Pathologie 45 6.2.3. Veränderungen der a-Synuclein -Immunreaktivität während des Alterungsprozesses von tg2576 Mäusen 47 6.2.4. Nachweis von α-Synuclein in Gliazellen 47 6.2.5. Kolokalisation von α-Synuclein und β-Amyloid im tg2576 Gehirn mit β-Amyloid-Pathologie 48 6.3. Ausblick 49 7. ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT 51 8. ABBILDUNGSVERZEICHNIS 55 9. TABELLENVERZEICHNIS 56 10. LITERATURVERZEICHNIS 56 11. ANHANG 65 11.1. Antikörper mit somatischer Färbespezifität 65 11.2. Antikörper mit primär synaptischer Färbespezifität 69 11.3. Doppelimmunfluoreszenz-Färbung α-Synuclein und β-Amyloid 74 12. ERKLÄRUNG ÜBER DIE EIGENSTÄNDIGE ABFASSUNG DER ARBEIT IV 13. LEBENSLAUF 14. DANKSAGUNG