Neuronale Vulnerabilität in humanen stammzellbasierten Modellen der Parkinson-Erkrankung
Neuronale Vulnerabilität in humanen stammzellbasierten Modellen der Parkinson-Erkrankung
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Original abstract
Hintergrund und Ziele: Das Parkinson-Syndrom (PS) ist durch neuronale Degeneration im Mittelhirn und Protein-Ablagerungen, die zum großen Teil aus aggregiertem alpha- Synuclein (α-Syn) bestehen, gekennzeichnet. Wie neuronaler Zelltod und neuronale Vulnerabilität mit der Aggregation von α-Syn beim PS in Verbindung stehen ist weitgehend unbekannt. Humane stammzellbasierte Modelle ermöglichen die Untersuchung molekularer Mechanismen von Erkrankungen des Nervensystems. Humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSZ) können aus adulten somatischen Zellen, wie z.B. Fibroblasten, mittels Reprogrammierung durch die Überexpression von bestimmten Pluripotenz-aktivierenden Transkriptionsfaktoren gewonnen werden. Im Weiteren können aus den hiPSZ Hirnregion-spezifische Neurone generiert werden. In der vorliegenden Arbeit sollen der Zelltod, die Menge von α-Syn Aggregaten und oxidativem Stress in Mittelhirn- und kortikalen Neuronen aus den hiPSZ von PS-Patienten und gesunde Kontrolle verglichen werden. Methoden HiPS-Zellen aus Fibroblasten von zwei PS Patienten mit einer Duplikation (Dupl) des α-Syn-Genlocus (SNCA) und eine passende Kontrolle wurden zu neuralen Vorläuferzellen (engl. Neural Precursor Cells [NPCs] bzw. small molecule Neural Precursor Cells [smNPCs]) und schließlich zu kortikalen beziehungsweise Mittelhirn-neuronalen Zellen differenziert. Die Aggregation von α-Syn in PS Dupl- und Kontroll- kortikalen und Mittelhirn-Neuronen wurden mittels eines Solubilitätsassays und Western Blot-Analyse ermittelt. Zur Beurteilung des oxidativen Stresses in den iPSZ Neuronen mit entsprechenden fluoreszierenden reaktiven Sauerstoffspezies (RSS)-Indikatoren (CellRox, MitoSox) behandelt und anschließend in einem Multimode-Mikroplattenleser gemessen wurden. Der neuronale Zelltod wurde mittels immunozytochemischer Färbung für den Apoptose-Marker aktivierte Caspase 3 untersucht. Die Zahl der apoptotischen kortikalen und Mittelhirn- Neuronen wurde anhand der Ko-Färbungen von aktivierten Caspase 3 mit dem neuronalen Marker β3-Tubulin und dem entweder Mittelhirn-Marker Tyrosinhydroxylase oder dem kortikalen Marker COUP TF-interacting protein 2 bestimmt. Anschließend wurden die gefärbten Neurone mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop und der Zen und ImageJ Software analysiert. Die Ergebnisse wurden mittels statistischer Methoden getestet. Ergebnisse und Beobachtungen In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Erhöhung der SNCA-Dosis keinen Einfluss auf die Differenzierung von Mittelhirn- und kortikalen Neuronen hatte. Gleichzeitig zeigten PS Mittelhirn-Neurone im Vergleich zu kortikalen Neuronen höhere RSS Konzentrationen und Proteinnitrierungswerte, was auf einen erhörten oxidativen Stress hindeutet. Außerdem wurde eine signifikant erhöhte Anzahl an apoptotischen Mittelhirn-Neuronen in PS Dupl im Vergleich zur Kontrolle gefunden. Dies galt jedoch nicht für kortikale Neuronen, wo die Zelltodrate vergleichbar niedrig war. Darüber hinaus wurde in PS Dupl Mittelhirn-Neuronen eine signifikant höhere Bildung von unlöslichen, phosphorylierten α-Syn Oligomeren als in den kortikalen PS Dupl Neuronen nachgewiesen. Schlussfolgerungen Die Aggregation von α-Syn ist ein bedeutendes Phänomen beim Verständnis der Mechanismen der Neurodegeneration in Synukleinopathien. In dieser Studie konnte eine Korrelation zwischen oxidativem Stress, der α-Syn Aggregation und dem vermehrten Zelltod der Mittelhirn-Neurone festgestellt werden. Zusammenfassend liefern diese Daten mechanistische Einblicke in die Toxizität von α-Syn Oligomeren in den menschlichen Neuronen und könnten therapeutisch wegweisend sein, da α-Syn Oligomere in frühen Stadien der Krankheit gebildet werden. State of the art: Parkinson’s disease (PD) is the most common neurodegenerative movement disorder characterized by protein intracellular inclusions mostly composed of aggregated forms of α-synuclein (α-Syn) and by the progressive degeneration of midbrain dopaminergic neurons (mDANs) in the substantia nigra (SN) of the midbrain (Kalia, Lang, PMID: 25904081). α-Syn is a small, physiologically soluble protein, predominantly located at the presynaptic site. The aggregation of α-Syn proceeds through monomers to aggregation intermediates (oligomers) into insoluble fibrils, which finally accumulate along with other components, forming Lewy bodies and Lewy neurites (Lashuel et al., PMID: 23254192). Among aggregated α-Syn species α-Syn oligomers are particularly toxic by triggering neurodegenerative processes in in vitro and in vivo models (Winner et al., PMID: 21325059). The relevance of α-Syn aggregation for the preferential loss of mDANs and the underlying mechanisms remain unclear. To elucidate the mechanisms of the brain region-specific neuronal vulnerability in PD, I modelled human PD using human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from two familial PD cases with a duplication (Dupl) of the α-Syn gene (SNCA) locus and a healthy control. Objective and hypothesis: Thus, the initial hypothesis of my project was that SNCA duplication (α-Syn Dupl) affects neuronal loss. Therefore, I aimed to analyze cell death of mDANs and in cortical projection neurons (CPNs) derived from iPSC of PD patients with α-Syn Dupl and a respective control. Results: Neuronal generation from iPSCs was comparable between Ctrl and PD Dupl iPSCs, indicating that gene dosage increase of SNCA does not impair neuronal differentiation. This finding suggests that there might be no major defects of neuronal development in PD Dupl cases. Further, we analyzed cell lysates of CPNs and mDANs derived from Ctrl and PD Dupl by denaturing sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and by Western blot. Increased high molecular weight α-Syn oligomers in PD Dupl mDANs could be determined, suggesting a particular predisposition of mDANs to form neurotoxic α-Syn species. Finally, increased neuronal death was observed in PD-derived mDANs compared to PD CPNs and to control mDANs and CPNs.