Spezifität von Anti-Alpha-Synuclein-Antikörpern - Erkenntnisse aus der durchflusszytometrischen Analyse
Spezifität von Anti-Alpha-Synuclein-Antikörpern - Erkenntnisse aus der durchflusszytometrischen Analyse
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Original abstract
Hintergrund und Ziele Die Akkumulation von Alpha-Synuclein (aSyn) ist das Charakteristikum einer Gruppe von neurodegenerativen Erkrankungen, die als Synucleinopathien bezeichnet werden. Die physiologischen Funktionen von aSyn, sowohl innerhalb als auch außerhalb des zentralen Nervensystems (ZNS), sind jedoch noch nicht vollständig geklärt. Eine verlässliche und reproduzierbare Bewertung der aSyn-Proteinexpression in verschiedenen Zelltypen, insbesondere in Zellen mit niedriger Expression, wird durch die Vielzahl schlecht charakterisierter Anti-aSyn-Antikörper und das Fehlen einer routinemäßig verwendeten sensitiven und spezifischen Detektionsmethode erschwert. In dieser Studie habe ich einen robusten durchflusszytometrischen Arbeitsablauf für den aSyn-Nachweis und die Antikörper-Validierung entwickelt. Methoden Ich habe drei handelsübliche Antikörper (MJFR1, LB509 und 2A7) in einem großen Spektrum humaner Zelltypen, einschließlich induzierter pluripotenter Stammzellen, T-Lymphozyten und Fibroblasten, getestet. Mithilfe von Peptid-Blocking-Experimenten wurde die Sensitivität für die aSyn-Detektion sowie mögliche Kreuzreaktionen gegen weitere Subtypen der Synuclein-Familie sowie Tubulin untersucht. Zusätzlich habe ich eine zell- und antikörperspezifische Kartierung der aSyn-Expression erstellt. Darüber hinaus habe ich den Antikörper 2A7 auf seine Fähigkeit hin untersucht, die physiologische Heterogenität in der aSyn-Expression zwischen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen aus kortikalen Organoiden zu detektieren. Abschließend wurde das Potenzial dieses Antikörpers zur Differenzierung des Proteingehalts zwischen gesunden Kontrollen und Parkinson-Patienten mit aSyn-Genlocus-Duplikation in neuronalen Vorläuferzellen und dopaminergen Neuronen des Mesencephalons analysiert. Ergebnisse und Beobachtungen In der systematischen Untersuchung konnte ich eine bisher nicht beobachtete Unspezifität des LB509-Antikörpers gegen Tubulin und verschiedene Synucleinformen nachweisen, während der MJFR1-Klon eine spezifische aSyn-Bindung zeigte, allerdings eine geringe Sensitivität aufwies. Im Gegensatz dazu zeigte der Antikörperklon 2A7 eine hohe Spezifität mit einer optimalen Empfindlichkeit für die Detektion von aSyn in einer Reihe von Zelltypen, einschließlich solcher mit geringer aSyn-Expression. Darüber hinaus war dieser imstande, die höheren Konzentrationen von aSyn in neuronalen Zellen zu erfassen und zeigte eine deutlich ausgeprägtere Expression dieses Proteins in der Duplikationslinie des aSyn-Gens. Schlussfolgerungen und Diskussion Auch wenn zwei der getesteten kommerziell erhältlichen aSyn-Antikörper ihre Anforderungen an die sensitive und spezifische Proteindetektion nicht erfüllten, habe ich den Antikörper 2A7 als geeignetes Werkzeug für die Erforschung der aSyn-Expression in verschiedenen Zelltypen identifiziert. Diese Ergebnisse liefern einen Grundsatzbeweis für den Einsatz der Durchflusszytometrie zur Analyse von aSyn und unterstreichen die Notwendigkeit einer strengen aSyn-Antikörper-Validierung, um die Erforschung der Physiologie und Pathologie dieses Proteins zu ermöglichen.