Acylated and unacylated ghrelin confers neuroprotection to mesencephalic neurons
Acylated and unacylated ghrelin confers neuroprotection to mesencephalic neurons
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Original abstract
Ghrelin ist ein Polypeptid, welches eine Reihe unterschiedlicher Funktionen erfüllt, wie z.B. die Regulation der Wachstumshormon-Freisetzung, die Regulation der Nahrungsaufnahme, eine prokinetische Wirkung auf den Gastrointestinaltrakt und die Beeinflussung der endokrinen Pankreasfunktion. Im Zusammenhang mit dem idiopathischen Parkinson-Syndrom (IPS) wurde festgestellt, dass Parkinson-Patienten dysregulierte postprandiale Ghrelinkonzentrationen im Blut haben. Zusätzlich konnten neuroprotektive Eigenschaften von acyliertem Ghrelin im Parkinson-Tiermodell nachgewiesen werden, die aber noch nicht detailliert erforscht sind. Ghrelin wird durch die Ghrelin-O-Acyltransferase (GOAT) von der nicht-acylierten in die acylierte Form umgewandelt. Diese Acylierung ist notwendig für die Bindung an den Ghrelinrezeptor GHS-R1a. Die Fragestellung der vorliegenden Arbeit war nun, inwiefern Ghrelin neuroprotektiv wirkt und ob dieser mögliche Effekt auf die acylierte Form beschränkt ist. Die Versuche wurden in Zellkulturen primärer, mesencephaler Neurone aus embryonalen Wistar-Ratten mit einem Gestationsalter von 15 Tagen durchgeführt. Wir führten unsere Experimente stets mit der acylierten und nicht-acylierten Ghrelinform durch. So konnten wir zeigen, dass beide Formen gegenüber einer Behandlung mit dem Neurotoxin MPP+, einem Hemmstoff des Komplexes I der mitochondrialen Atmungskette, neuroprotektiv auf dopaminerge Neurone wirken. Dabei lag das Wirkmaximum von acyliertem Ghrelin bei 0,1 nM und von der nicht-acylierten Form 10-fach höher, also bei 1 nM. Dieser Unterschied der Wirkmaxima wurde auch schon in Versuchen an Pankreaszellen festgestellt. Auch gegenüber dem Neurotoxin 3-Nitropropionsäure (3-NP), welches den Komplex II der Atmungskette hemmt, wirkten beide Ghrelinformen neuroprotektiv, wieder mit dem Wirkmaximum bei 0,1 bzw. 1 nM. Da die Neurotoxizität der 3-NP sich nicht auf dopaminerge Zellen beschränkt wie die des MPP+, untersuchten wir die Wirkung beider Ghrelinformen auf alle weiteren mesencephalen Neurone. Es zeigte sich, dass die Neuroprotektion unabhängig vom neuronalen Phänotyp war. In der Entstehung des IPS spielen eine Reihe von Pathomechanismen eine Rolle, so auch die elektrische Aktivität der dopaminergen Neurone. So führt z.B. ein massiver Kalzium- oder Kaliumeinstrom in die Zelle letztendlich zum Untergang dopaminerger Neurone. Die chronische Einnahme von Kalziumkanal-Blockern (L-Typ, Dihydropyridin-Typ) führt in einer Studie zu einer Reduktion des Erkrankungsrisikos. So stellte sich für uns die Frage, ob die neuroprotektive Eigenschaft von Ghrelin im Zusammenhang mit Ionenströmen stehen könnte. Die Hemmung des L-Typ-Kalziumkanals mit Nicardipin verhinderte die Wirkung von acyliertem und nicht-acyliertem Ghrelin in allen mesencephalen Neuronen. Aus früheren Studien ergab sich die Überlegung, dass die Wirkung von nicht-acyliertem Ghrelin auf einer Umwandlung in die acylierte Form beruht. Dazu haben wir die Wirkung beider Ghrelinformen im Zusammenhang mit dem GHS-R1a-Antagonisten [D-Lys3]-GHRP-6 untersucht. Eine Antagonisierung des Rezeptors führte zu einem Wirkverlust von acyliertem Ghrelin, nicht aber der nicht-acylierten Form. Somit liegt nahe, dass die Wirkung von nicht-acyliertem Ghrelin über einen anderen Mechanismus vermittelt wird. Dies wurde bestätigt durch Versuche mit dem GOAT-Hemmer GO-Tat-CoA, der die Wirkung von nicht-acyliertem Ghrelin nicht abschwächte. Daraus lässt sich schließen, dass die neuroprotektive Wirkung der nicht-acylierten Form nicht auf einer Umwandlung in die acylierte Form zurückzuführen war. Zusammengefasst konnten wir zeigen, dass nicht nur acyliertes, sondern auch nicht-acyliertes Ghrelin eine neuroprotektive Wirkung auf mesencephale Neurone hat. Diese Protektion ist abhängig von L-Typ-Kalziumkanälen, wird aber bei beiden Ghrelinformen über unterschiedliche Mechanismen vermittelt. Ghrelin is a polypeptide that exerts a wide range of functions, such as the regulation of growth hormone secretion, energy homeostasis, food intake, as well as the exocrine function of the pancreas. In regard to Parkinson’s disease (PD), patients who have been diagnosed with PD exhibit reduced levels of circulating ghrelin and a reduced postprandial ghrelin response. Experimental studies revealed neuroprotective effects of acylated ghrelin in different models of PD, which have not been further elucidated to date. There are two major molecular forms of ghrelin, an acylated (AG) and an unacylated (UAG) form. The acylation is catalyzed by the ghrelin-O-acyltransferase (GOAT) and only AG is able to bind to and activate the growth hormone secretagogue receptor 1a (GHS-R1a). The issue we examined was whether ghrelin would exhibit neuroprotektive properties in our cell culture model and if this effect was limited to the acylated form. The study was conducted in primary mesencephalic cultures isolated from rat embryos at a gestational age of 15 days of pregnant Wistar rats. First, we investigated the neuroprotective effects of AG and UAG on dopaminergic neurons after treatment with the complex I inhibitor MPP+. Both ghrelin forms were neuroprotective, showing the maximum effect at a concentration of 0.1 nM AG and 1 nM UAG, ten times higher than the necessary concentration of AG. Concurrently, a tenfold higher concentration of UAG was also needed in experiments performed on pancreatic cells. Next, we investigated whether the observed effect was also evident when cells were treated with the complex II inhibitor 3-nitropropionic acid (3-NP). We found that both AG and UAG also protected midbrain neurons against complex II inhibition regardless of their neuronal phenotype, showing a maximum effect with the same concentrations as reported above. There is a set of pathomechanisms responsible for the development of PD, such as the electrical activity of dopaminergic neurons. A massive influx of calcium or potassium ultimately leads to the loss of dopaminergic neurons. Chronic intake of calcium channel inhibitors (L-type / dihydropyridine-type) lowers the risk for PD. We analyzed whether co-treatment with the L-type channel blocker nicardipine could alter the neuroprotective effect of ghrelin after 3-NP exposition. Nicardipine abolished the neuroprotective effect of both AG and UAG on all mesencephalic neurons. Traditionally, AG has been regarded as the only active form of ghrelin due to its receptor binding properties and UAG was thought to exhibit its effect after conversion to AG. To ascertain that the effects of UAG are not due to its in vitro acylation into AG, we assessed the effects of UAG in the presence of the GSH-R1a antagonist [D-Lys3]-GHRP-6 and the GOAT-inhibitor GO-CoA-Tat. Whereas the effect of AG on mitochondrial impairment required GSH-R1a binding, effects of UAG remained unaffected by treatment with a GSH-R1a antagonist. Importantly, inhibition of ghrelin-O-acyltransferase failed to reduce the activity of UAG. In conclusion, our data suggests that both AG and UAG afford protection to dopaminergic neurons. This protective effect requires the activation of L-type calcium channels, however, it is transmitted through different mechanisms for both molecular forms of ghrelin.