Proteinhomöostase in Drosophila Photorezeptoren
Proteinhomöostase in Drosophila Photorezeptoren
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Building upon this finding, a systematic characterization of the UFL1 interaction environment was conducted, along with an investigation of its potential role in regulating phototransduction in the Drosophila eye.Location evidence
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Original abstract
Diese Dissertation befasst sich mit der Phototransduktion in den Photorezeptorzellen von Drosophila melanogaster. Im Mittelpunkt steht die Analyse der Proteininteraktionsnetzwerke rund um das Rhodopsin-Protein (Rh1) und die E3-UFM1-Ligase UFL1. Ausgangspunkt der Arbeit war die Untersuchung von Proteininteraktionsnetzwerken rund um das Rhodopsin- Protein (Rh1), einem zentralen Rezeptor der Phototransduktion. Dabei konnte die E3-UFM1- Ligase UFL1 als potenzieller Interaktionspartner identifiziert werden. Darauf aufbauend erfolgte eine systematische Charakterisierung der UFL1-Interaktionsumgebung sowie die Untersuchung ihrer möglichen Rolle bei der Regulation der Phototransduktion im Auge von Drosophila. Zur Untersuchung dieser Netzwerke wurde das Proximity-Labeling-System TurboID für den Einsatz in Drosophila etabliert. Durch Fusion von TurboID an Rh1 konnten physiologisch relevante Interaktionspartner identifiziert werden. Dabei wurden unter anderem Vap33, Sec22, Orp8 und PIP82 als potenzielle Interaktionspartner von Rh1 bestimmt. Vap33 ist homolog zum menschlichen VAPB-Protein, dessen Mutationen (z. B. P56S) mit der Amyotrophen Lateralsklerose (ALS) assoziiert sind155. Diese evolutionär konservierte Funktion deutet darauf hin, dass die in Drosophila gewonnenen Erkenntnisse auch zum Verständnis neurodegenerativer Mechanismen beim Menschen beitragen können. Darüber hinaus wurde die Interaktionslandschaft der E3-Ligase UFL1 in den Rhabdomeren detailliert charakterisiert. Zu den potenziellen identifizierten Interaktionspartnern gehörten Vap33, RdgB, Arrestin2, ninaC, PIP82 sowie der Kationenkanal TRPL. Mithilfe UFM1- spezifischer Antikörper und massenspektrometrischer Analysen konnte gezeigt werden, dass Arrestin2 und TRPL einer UFMylierung unterliegen. Für Arrestin2 wurden die Lysinreste K224 und K355 als UFMylierungsstellen identifiziert. Zudem konnte erstmals nachgewiesen werden, dass auch UFL1 selbst UFMyliert ist. Da eine Selbst-UFMylierung von UFL1 bisher nicht beschrieben wurde, deuten diese Befunde auf eine bislang unbekannte Regulationsschicht innerhalb des UFMylierungssystems hin, die möglicherweise die Aktivität, Stabilität oder Interaktionen von UFL1 in membranassoziierten Komplexen moduliert. Funktionelle Analysen zeigten, dass die Herunterregulierung der UFM1- Konjugationsmaschinerie, beispielsweise durch Knockdown von Uba5, die lichtinduzierte Translokation von Arrestin2 signifikant beeinträchtigt. Dies unterstreicht die zentrale Rolle der UFMylierung in der Regulation der Phototransduktionskaskade. Da Rhodopsin ein lichtempfindlicher Vertreter der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) ist, deren Struktur und Signalmechanismen evolutionär hochkonserviert sind und die beim Menschen zentrale Rollen in physiologischen Prozessen spielen, liefern die Ergebnisse dieser Arbeit neue Einsichten in grundlegende Prinzipien der GPCR-vermittelten Signaltransduktion. Die konservierte Funktion von Arrestin sowie die pathophysiologische Relevanz von Vap33/VAPB unterstreichen den translationalen Wert dieses Modellsystems. Drosophila-Photorezeptoren erweisen sich als wertvolles Modellsystem, das wesentliche Beiträge zum Verständnis menschlicher Netzhautdegenerationen wie Retinitis Pigmentosa sowie neurodegenerativer Erkrankungen einschließlich Alzheimer- und Parkinson-Krankheit leisten kann. Insgesamt erweitern die hier präsentierten Ergebnisse das Verständnis der molekularen Mechanismen der Phototransduktion in Drosophila melanogaster und etablieren die UFMylierung – insbesondere von Arrestin2 und UFL1 – als neuen regulatorischen Mechanismus. This dissertation focuses on phototransduction in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster. The main emphasis is on the analysis of protein interaction networks surrounding the rhodopsin protein (Rh1) and the E3 UFM1 ligase UFL1. The starting point of this work was the investigation of protein interaction networks associated with Rh1, a central receptor in phototransduction. In this context, the E3 UFM1 ligase UFL1 was identified as a potential interaction partner. Building upon this finding, a systematic characterization of the UFL1 interaction environment was conducted, along with an investigation of its potential role in regulating phototransduction in the Drosophila eye. To study these networks, the proximity-labeling system TurboID was established for use in Drosophila. By fusing TurboID to Rh1, physiologically relevant interaction partners could be identified. Among them, Vap33, Sec22, Orp8, and PIP82 were determined as potential Rh1 interaction partners. Vap33 is homologous to the human VAPB protein, whose mutations (e.g., P56S) are associated with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) [155]. This evolutionarily conserved function suggests that insights gained in Drosophila may also contribute to understanding neurodegenerative mechanisms in humans. Furthermore, the interaction landscape of the E3 ligase UFL1 in rhabdomeres was characterized in detail. The identified potential interaction partners included Vap33, RdgB, Arrestin2, PIP82, and the cation channel TRPL. Using UFM1-specific antibodies and mass spectrometric analyses, it was demonstrated that Arrestin2 and TRPL undergo UFMylation. For Arrestin2, lysine residues K224 and K355 were identified as UFMylation sites. Moreover, it was demonstrated for the first time that UFL1 itself is UFMylated. Since self-UFMylation of UFL1 has not been previously described, these findings suggest a previously unknown regulatory layer within the UFMylation system that may modulate the activity, stability, or interactions of UFL1 in membrane-associated complexes. Functional analyses showed that downregulation of the UFM1 conjugation machinery, for example through knockdown of Uba5, significantly impairs the light-induced translocation of Arrestin2. This underscores the central role of UFMylation in regulating the phototransduction cascade. As rhodopsin is a light-sensitive member of the G protein-coupled receptors (GPCRs), whose structure and signaling mechanisms are evolutionarily highly conserved and play central roles in human physiological processes, the results of this work provide new insights into fundamental principles of GPCR-mediated signal transduction. The conserved function of arrestin and the pathophysiological relevance of Vap33/VAPB highlight the translational value of this model system. Drosophila photoreceptors prove to be a valuable model system that can provide key insights into human retinal degenerations such as retinitis pigmentosa, as well as neurodegenerative diseases including Alzheimer’s and Parkinson’s disease. Overall, the results presented here expand the understanding of the molecular mechanisms of phototransduction in Drosophila melanogaster and establish UFMylation-particularly of Arrestin2 and UFL1- as a novel regulatory mechanism.