Trifluoperazin schützt humane dopaminerge Zellen durch Aktivierung der Autophagie vor Wildtyp-Alpha-Synuklein-induzierter Toxizität
Trifluoperazin schützt humane dopaminerge Zellen durch Aktivierung der Autophagie vor Wildtyp-Alpha-Synuklein-induzierter Toxizität
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Original abstract
Die Parkinson-Erkrankung ist die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung nach der Alzheimer-Demenz. In industrialisierten Ländern liegt die Prävalenz der Erkrankung bei knapp zwei Prozent für alle Personen über 65 Jahren. Klinisch ist die Erkrankung charakterisiert durch Bradykinese, Rigor, Ruhetremor und posturale Instabilität. Diese motorischen Symptome sind hauptsächlich durch einen Verlust dopaminerger Neurone in der Substantia nigra pars compacta verursacht. Das histopathologische Kennzeichen der Parkinson-Krankheit ist die Präsenz von intraneuronalen Einschlüssen, sogenannten Lewy-Körperchen, in überlebenden Neuronen der Substantia nigra pars compacta. Die Hauptkomponente der Lewy-Körperchen ist Alpha-Synuklein, ein Protein bestehend aus 140 Aminosäuren. Sinnverändernde Mutationen, Duplikationen und Triplikationen des Alpha-Synuklein-Gens führen zu seltenen genetischen Parkinson-Syndromen. Zudem haben genomweite Assoziationsstudien eine Vielzahl an Risikogenvarianten des Alpha-Synuklein-Gens als Risikofaktor für die Parkinson-Krankheit identifiziert. Aus diesen Gründen ist es heutzutage unbestritten, dass Alpha-Synuklein eine zentrale Rolle in der Entstehung der Parkinson-Krankheit spielt; allerdings ist weiterhin unklar, welche Alpha-Synuklein-Form die Neurodegeneration vermittelt. Bislang lindert die pharmakologische Therapie lediglich die Symptome der Parkinson-Krankheit und es existiert keine Therapie, die die Progression der Erkrankung nachweisbar verzögert oder gar aufhält. In unserer Forschungsgruppe wurde ein neues Zellkulturmodell der Parkinson-Krankheit entwickelt, in welchem die Überexpression des Alpha-Synuklein-Wildtyps durch adenovirale Transduktion zum Zelltod von humanen, postmitotischen, dopaminergen Neuronen (LUHMES-Zellen) führt. Ein Prozess der zellulären Homöostase um pathologische intrazelluläre Einschlüsse abzubauen, ist die Makroautophagie. Ziel dieser Dissertation war es deswegen zu untersuchen, ob Trifluoperazin, ein bekannter Aktivator der Makroautophagie in Neuronen, dopaminerge Zellen vor Wildtyp-Alpha-Synuklein-induzierter Toxizität schützen kann. Zunächst wurde durch Western-Blot-Analysen gezeigt, dass Trifluoperazin Makroautophagie auch in den hier verwendeten LUHMES-Neuronen aktiviert. Anschließend konnte nachgewiesen werden, dass diese Substanz tatsächlich die Zellen dosisabhängig vor Alpha-Synuklein-vermitteltem Zelltod schützt. Die dazu verwendeten Auswertungsmethoden umfassten die Messung der LDH-Konzentration im Zellkulturmedium sowie das Auszählen vitaler Zellen und apoptotischer Zellen nach der Zellfixierung und Färbung mittels DAPI. Die Überexpression von Wildtyp-Alpha-Synuklein führte zusätzlich zur Toxizität auch zum Erscheinen einer 37-kDa-Alpha-Synuklein-Western-Blot-Bande, welche in nicht-transduzierten Zellen nicht nachweisbar war. Interessanterweise konnte die Intensität dieser 37-kDa-Alpha-Synuklein-Bande durch Behandlung mit Trifluoperazin spezifisch und dosisabhängig reduziert werden, ohne die restlichen Alpha-Synuklein-Banden signifikant zu verändern. Chloroquin, ein Inhibitor der Autophagie, verstärkte passend dazu sowohl die Alpha-Synuklein-induzierte Toxizität als auch die 37-kDa-Alpha-Synuklein-Bande. Es ergab sich eine signifikante positive Korrelation zwischen der Toxizität und der Stärke dieser Western-Blot-Bande. Diese Daten legen den Schluss nahe, dass diese oligomerische Alpha-Synuklein-Bande eine Schlüsselrolle in der Alpha-Synuklein-vermittelten Toxizität zumindest innerhalb dieses Zellkulturmodells der Parkinson-Krankheit einnimmt. Der eigene Einfluss von Alpha-Synuklein auf die Makroautophagie (aktivierend oder hemmend) ist nach wie vor nicht vollständig geklärt. Die Ergebnisse der in dieser Dissertation durchgeführten Experimente lassen die Interpretation zu, dass eine Überexpression des Alpha-Synuklein-Wildtyps die Makroautophagie hemmt. Die Kernaussage dieser Doktorarbeit ist, dass die Aktivierung der Autophagie humane, postmitotische, dopaminerge Zellen vor Wildtyp-Alpha-Synuklein-induzierter Toxizität durch Abbau einer spezifischen Alpha-Synuklein-Form schützt. Diese Ergebnisse unterstützen die These, dass Autophagie-Aktivierung einen möglichen Ansatz in der Therapie der Parkinson-Krankheit darstellt. Zudem wurde eine 37-kDa-Alpha-Synuklein-Bande mittels Western Blot identifiziert, welche womöglich auch in der Pathogenese der Parkinson-Krankheit eine Rolle spielt. Parkinson’s disease is the second most common neurodegenerative disease after Alzheimer’s disease and effects nearly two percent of all people aged 65 or older in industrialized countries. Clinically it is characterized by bradykinesia, rigidity, tremor, and postural instability. These motor symptoms are mainly caused by the demise of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta. The histopathological hallmark of Parkinson’s disease is the presence of intracellular protein inclusions, called Lewy bodies, in cells of the substantia nigra pars compacta. The main component of Lewy bodies is alpha-synuclein, a 140 amino acids long protein. Missense mutations, duplications or triplications of the alpha-synuclein gene (SNCA) lead to rare familial forms of Parkinson’s disease. Moreover, genome-wide-association studies identified variants of SNCA as risk factors for sporadic Parkinson’s disease. For these reasons it is undisputed, that alpha-synuclein plays a major role in the development of Parkinson’s disease. However, so far the precise alpha-synuclein species responsible for neuronal death is controversially debated. To date, pharmacological therapies of Parkinson’s disease are only symptomatic and there is no known therapy that halts or slows the progression of the disease. In our research group a new cell culture model of Parkinson’s disease was developed, in which adenoviral overexpression of wild-type alpha-synuclein leads to cell death in human postmitotic dopaminergic neurons (LUHMES cells). One cellular mechanism to dispose unwanted protein inclusions is macroautophagy. Therefore, the goal of this dissertation was to investigate if trifluoperazine, a known enhancer of macroautophagy in neurons, protects these dopaminergic cells from alpha-synuclein-mediated toxicity. First of all, Western blot analysis was used to show that trifluoperazine activated macroautophagy in LUHMES neurons. Then it could be proven that treatment with this compound protected LUHMES cells from alpha-synuclein-induced cell death in a concentration-dependent manner. The readout methods to measure cell death or survival comprised release of LDH into the cell culture medium as well as cell count after nuclear staining with DAPI. Besides toxicity, overexpression of alpha-synuclein in this cell model led to the appearance of a small oligomeric band of alpha-synuclein with a molecular weight of 37 kDa, which was not present in untransduced cells. Trifluoperazine reduced specifically this 37 kDa alpha-synuclein Western blot band in a dose-dependent manner without altering other alpha-synuclein bands. Inversely, inhibition of autophagy by chloroquine, a known inhibitor of autophagy, increased the toxicity of alpha-synuclein and this 37 kDa band, too. There was a significant positive correlation between toxicity and the strength of this band. These data strongly suggest that this 37 kDa band is a key form implicated in the toxicity of alpha-synuclein at least in our cell model of Parkinson’s disease. Additionally, from the experiments in this dissertation it can be concluded that overexpression of alpha-synuclein inhibits macroautophagy – the impact of alpha-synuclein itself on autophagy is so far a heavily debated question, too. In summary, it was shown that enhancement of autophagy saved human dopaminergic cells from alpha-synuclein-induced toxicity by degradation of a specific alpha-synuclein species only seen under pathological conditions. This suggests that activation of autophagy might be a possible target for a disease modifying pharmacotherapy for Parkinson’s disease in the future. Furthermore, a 37 kDa alpha-synuclein band was seen, which might be a key toxic species in Parkinson’s disease.