Determination of the subcellular distribution of α-synuclein during neuronal differentiation
Determination of the subcellular distribution of α-synuclein during neuronal differentiation
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Original abstract
Zahlreiche Studien belegen, dass das Protein α-Synuklein (α-Syn) bei der molekularen Pathogenese des idiopathischen Parkinson Syndroms (IPS) eine Schlüsselrolle besitzt. Beim IPS kommt es zu einer weitgehend selektiven Degeneration der dopaminergen Neuronen, die mit dem gehäuften Vorkommen von α-Syn zusammenhängt (Burré, 2015). Die mechanistische Ursache für die Vulnerabilität gegenüber der α-Syn Pathologie konnte bis heute nicht aufgeklärt werden. Unter physiologischen Bedingungen ist α-Syn in den präsynaptischen Terminalen reifer Neuronen angereichert. In neuronalen Vorläuferzellen ließ sich das Protein in den Neuriten lokalisieren. Maroteaux und Scheller (1991) hingegen konnten α-Syn zu Beginn der neuronalen Entwicklung im Zellkern ausfindig machen. Meine Dissertation befasste sich mit der Frage, ob es während der Differenzierung von Neuronen zu einer Umverteilung von α-Syn aus dem Zellkern an die Synapsen kommt. Es sollte geklärt werden, ob eine Abweichung von der hypothetisierten subzellulären Verteilung zur Pathogenese des IPS beitragen könnte. Für die Untersuchungen wurden neben dopaminerg differenzierten LUHMES Zellen und iPSZ-basierten Neuronen von Patienten mit IPS, kortikale Zellkulturen aus der Ratte gewählt. In den LUHMES Zellen konnte ich die hypothetisierte Umverteilung von α-Syn im dopaminergen Zellsystem zum Teil bestätigen. Darüber hinaus demonstrieren die Daten aus den Untersuchungen der LUHMES und der iPSZ-basierten Zellkultur, dass distinkte α-Syn Spezies existieren, welche sich zwischen dem nukleären und dem zytosolischen Kompartiment unterscheiden. Hochmolekulare Spezies, die vom AP 15807 Antikörper gegen α-Syn erkannt werden, reduzierten sich während der Differenzierung im nukleären Kompartiment. Im fortgeschrittenen Differenzierungsverlauf verlagerte sich eine 50 kDa Spezies aus dem Soma in die Neuriten. Das subzelluläre Verteilungsmuster in den kortikalen Zellen ergab, dass sich die Umverteilung nicht auf das dopaminerge System beschränkt. Die Analyse der kortikalen Zellkultur belegt zudem, dass sich α-Syn nicht nur in die Neuriten, sondern explizit an die Synapsen und innerhalb dieser bevorzugt an solche des inhibitorischen Typs begibt. Zwischen gesunden Kontrollpersonen und Patienten mit IPS waren bei der Identifizierung verschiedener α-Syn Spezies keine Unterschiede feststellbar. Dennoch ist die Ergründung des Zusammenbaus und der Destabilisierung der multimeren Spezies als aussichtsvoller Ansatzpunkt zu nennen. Die Identifizierung der subzellulär distinkt verteilten Spezies unter physiologischen Bedingungen gelang erstmals im Rahmen dieser Arbeit. Die vorliegende Dissertation könnte für eine zukünftige Isolation multimerer α-Syn Spezies als Vorlage dienen. Numerous studies confirm a central role for the protein α-synuclein (α-syn) in the molecular pathogenesis of idiopathic Parkinson’s disease (iPD). The disease is characterized by a largely selective degeneration of the dopaminergic neurons which is explained partly by the high occurrence of α-syn (Burré, 2015). The mechanism behind the vulnerability of dopaminergic neurons to α-syn pathology remains unclear. α-syn is enriched at presynaptic terminals of mature neurons under physiological conditions. In neuronal precursor cells, α-syn is localized within the neurites. A nuclear localization, however, was observed by Maroteaux und Scheller (1991) at the beginning of neuronal differentiation. In this thesis I asked the question, whether α-syn translocates from the cell nucleus to the synapse during neuronal differentiation. Also, the intention was to investigate whether a deviation to the hypothesized subcellular distribution could contribute to the pathogenesis of iPD. For this purpose, Lund human mesencephalic (LUHMES) cells and iPD-patient-derived cells generated from induced pluripotent stem cells were differentiated into dopaminergic neurons. In addition to the dopaminergic cell models, primary rat cortical cells were analyzed. I partially confirmed the hypothesized redistribution of α-Syn within the LUHMES cells in a dopaminergic cell system. Furthermore, the data from LUHMES and iPS cell analysis implicate the existence of distinct α-syn species that can be distinguished by their nuclear or cytosolic residence. Highmolecular weight species, recognized by the AP 15807 antibody against α-syn, have been reduced in the nuclear compartment during neuronal differentiation. During the further differentiation process, a 50 kDa species translocated from the soma into the neurites. The subcellular protein pattern of α-syn within the cortical neurons showed that the translocation is not restricted to the dopaminergic cell system. The study of the cortical neurons also demonstrates, that α-syn does not only enter the neurites, but explicitly reaches the synapses, particularly those of the inhibitory type. Those observations revealing distinct α-syn protein patterns were comparable between patients with iPD and healthy volunteers. Nevertheless, mention can be made of investigating the assembly and destabilization of multimeric species as a promising target point. Within the framework of this thesis, subcellularly distinctively distributed species were identified for the first time under physiological conditions. Thus, in future this dissertation could find application as a manual for the isolation of multimeric α-syn species.