Clonaggio e purificazione delle 7 isoforme umane di 14-3-3, per un'analisi comparativa del loro ruolo nella malattia di Parkinson.
Clonaggio e purificazione delle 7 isoforme umane di 14-3-3, per un'analisi comparativa del loro ruolo nella malattia di Parkinson.
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Original abstract
Le 14-3-3 sono una famiglia di proteine capaci di legare centinaia di interattori diversi e di svolgere numerose funzioni, molte delle quali probabilmente ancora sconosciute. Il fatto che queste proteine interagiscano con varie proteine associate al PD, come LRRK2, α-sinucleina e tirosin idrossilasi, lascia supporre che possano rappresentare un anello di congiunzione fra le varie cause di questa malattia neurodegenerativa. Indagini sul ruolo delle 14-3-3 nel PD sono complicate dal fatto che, nell’uomo, sono presenti 7 isoforme, le quali potrebbero avere funzioni differenti tessuto-specifiche. Lo scopo di questa tesi è quello di clonare, esprimere e purificare le 7 isoforme umane di 14-3-3 in modo da poter intraprendere un’analisi comparativa del loro ruolo fisiologico e/o patologico nel contesto del PD. In particolare, dopo aver clonato e messo a punto un protocollo di purificazione per tutte le isoforme, è stato effettuato un esperimento preliminare per identificare quali di esse siano coinvolte nel processo di fibrillazione dell’α-sinucleina in vitro. Inoltre è stato fatto un primo tentativo di coimmunoprecipitazione in vitro tra 14-3-3 e LRRK2 ricombinanti al fine di studiare l’interazione isoforma specifica. Prima di procedere con questo esperimento, è stato valutato il livello di fosforilazione delle due serine di LRRK2 necessarie per il legame con le 14-3-3 e il possibile coinvolgimento della PKA in questa interazione.