Dopaminergic differentiation of adult human hippocampal stem cells
Dopaminergic differentiation of adult human hippocampal stem cells
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Original abstract
Hintergrund und Ziele: Nachdem seit der ersten Hälfte des letzten Jahrhunderts durch mehrere Experimente adulte Neurogenese schließlich nachgewiesen und somit Cajals Dogma widerlegt werden konnte, erlebten die Neurowissenschaften durch die Möglichkeit zur Isolation adulter neuraler Stammzellen ein exponentielles Wachstum. Gleichzeitig mit der basiswissenschaftlichen Aufarbeitung der adulten Neurogenese sowohl im Tier, als auch im Menschen, kam die Idee der therapeutischen Verwendung dieser, vor allem zur Therapie des Morbus Parkinson, auf. Die lediglich vereinzelt erfolgreichen Versuche der Transplantation von embryonalem oder fetalem mesencephalen Gewebe in das Corpus striatum von an Morbus Parkinson erkrankten Patienten bekräftigten zwar das Prinzip der Zellersatztherapie, zeigten jedoch auch die Notwendigkeit der weiteren Erforschung der Mechanismen in der Entwicklung dopaminerger Neurone aus (neuralen) Stammzellen. In dieser Arbeit soll die Möglichkeit überprüft werden, ob adulte humane hippocampale Stammzellen die Fähigkeit besitzen in dopaminerge Nervenzellen zu differenzieren. Hierfür soll ein vorbestehendes Differenzierungsprotokoll entsprechend modifiziert werden. Die experimentellen Arbeiten wurden im Zeitraum von 2009 bis 2011 durchgeführt und finanziell durch die Forschungsinitiative ForNeuroCell des Bayerischen Staatsministeriums für Wissenschaft, Forschung und Kunst unterstützt. Methoden: Aus dem Gyrus dentatus von sechs Patienten, die sich im Jahr 2009 an der Universitätsklinik für Neurochirurgie Erlangen aufgrund einer therapierefraktären Temporallappenepilepsie einem neurochirurgischem Eingriff unterzogen hatten, wurden adulte humane hippocampale Stammzellen isoliert. Diese wurden in der Zellkultur expandiert und schließlich einem siebentägigen Differenzierungsprotokoll zugeführt. Hierbei wurden verschieden Moleküle getestet, die für die dopaminerge Differenzierung wichtig sind, wie z.B. Sonic hedgehog (SHH) oder Fibroblast growth factor 8 (FGF8). Die anschließende Auswertung bezüglich eines dopaminergen Phänotyps der Zellen erfolgte durch Immunfluoreszenzfärbungen, Bestimmung der Proteinexpression durch Western-Blot-Analysen sowie der Genexpression durch PCR-Analysen und durch elektrophysiologische Untersuchungen. Ergebnisse und Beobachtungen: Adulte humane hippocampale Stammzellen konnten erfolgreich isoliert und expandiert werden. Die Analyse der Immunfluoreszenzfärbungen zeigte, dass durch die Anwendung des beschriebenen Differenzierungsprotokolls eine nennenswerte dopaminerge Differenzierung stattfindet, die vor allem auf den Einfluss der Signalmoleküle SHH und FGF8 zurückzuführen ist. Die Ergebnisse der Auswertung der Expression von Markern des neuronalen Reifungsprozesses, Nestin und ß-III-Tubulin, sowie von charakteristischen Marker mesencephaler dopaminerger Neurone, Tyrosinhydroxylase, Nurr1 und Pitx3, auf Gen- und Proteinebene waren allerdings nicht signifikant oder sogar widersprüchlich. Lediglich auf Proteinebene ergaben sich Hinweise auf eine dopaminerge Differenzierung der adulten humanen hippocampalen Stammzellen. In den elektrophysiologischen Untersuchungen konnten einwärts gerichtete Natriumströme als Kriterium funktioneller Neurone nachgewiesen werden. Praktische Schlussfolgerungen: Die Analyse der Immunfluoreszenzfärbungen weist auf das Potential adulter humaner hippocampaler Stammzellen hin, dopaminerge Nervenzellen durch spezifische Differenzierungsprotokolle zu generieren. Eine weitere detaillierte Charakterisierung der hierdurch gewonnenen Neurone ist notwendig. Die klinische Translation einer erfolgreichen Generierung dopaminerger Neurone aus adulten humanen hippocampalen Stammzellen würde das Spektrum der Therapie des Morbus Parkinson erweitern und wird in dieser Dissertation kritisch diskutiert. Naheliegend wäre der Ansatz der Transplantation von in vitro generierten dopaminergen Neuronen oder deren Vorläuferzellen. Alternativ besteht der Ansatz der zellfreien Therapie. Basierend auf den in in vitro gewonnenen Erkenntnissen über involvierte Signalkaskaden könnte eine Transplantation umgangen werden, indem der endogene Stammzellpool durch exogene Stimuli selbst zur Generierung neuer dopaminerger Neurone angeregt wird. Background and objective: Starting in the first half of the last century, several experiments have evidenced adult neurogenesis and, thereby, proven Cajal´s Dogma wrong. The successful isolation of adult neural stem cells led to further interest for translational studies. Increasing knowledge about neurogenesis in animals as well as in humans supported the idea of therapeutic application, especially in Parkinson´s Disease. Attempts of transplanting embryonic or fetal tissue into the corpus striatum of Parkinson´s disease patients have shown however little success and demonstrated the necessity of further basic research to unravel the development of dopaminergic neurons. This thesis will test the possibility of targeted dopaminergic differentiation of adult human hippocampal stem cells in vitro. Methods: Adult human hippocampal stem cells were isolated from dentate gyrus of six surgical hippocampal specimens. These were obtained from patients who underwent epilepsy surgery at the Erlangen Epilepsy Centre for drug-resistant mesial temporal lobe epilepsy. Adult human hippocampal stem cells were expanded in culture and finally differentiated for seven days using a modified differentiation protocol. Dopaminergic differentiation was determined by immunofluorescence analysis, protein analysis using Western-Blot, gene analysis using PCR and electrophysiological studies. Results and observations: Adult human hippocampal stem cells were successfully isolated and expanded in vitro. Immunofluorescence analysis proved a high percentage of dopaminergic differentiation, attributed to the addition of SHH and FGF8. Protein and gene analysis of nestin, ß-III-tubulin, Th, Nurr1 and Pitx3 showed no significant or inconsistent results. Only protein analysis pointed to a dopaminergic differentiation of the adult human hippocampal stem cells. Electrophysiological studies showed inward sodium currents pointing to a neuronal differentiation. Conclusions: The results of the immunofluorescence analysis proved dopaminergic differentiation of adult human hippocampal stem cells using this differentiation protocol. However, the nature of these differentiated neurons needs further evaluation. Clinical translation of a successful generation of dopaminergic neurons from adult human hippocampal stem cells should be considered as a further therapeutic approach to Parkinson´s disease. On the one hand, in vitro generated dopaminergic neurons or their precursors could be transplanted. On the other hand, the endogenous stem cell pool could be stimulated by exogenic stimuli using the knowledge deduced from in vitro studies.